Los alquilfosfolípidos (APL) han sido estudiados como fármacos anticancerígenos que interfieren con las membranas biológicas sin dirigirse al ADN. Aunque su mecanismo de acción aún no está completamente elucidado, se sabe que interrumpen el tráfico intracelular de colesterol y su metabolismo. Aquí, analizamos si los APL también podrían interferir con la función mitocondrial. Para este propósito, utilizamos células de cáncer colorrectal HT29, derivadas de un tumor primario, y células de cáncer colorrectal SW620, derivadas de un sitio de metástasis. Después del tratamiento con los APL miltefosina y perifosina, analizamos varios parámetros mitocondriales, incluyendo la masa mitocondrial, el contenido de cardiolipina, el potencial de membrana mitocondrial, la producción de HO, los niveles de complejos de fosforilación oxidativa (OXPHOS), la actividad de enzimas metabólicas, la tasa de consumo de oxígeno y los niveles de marcadores de apoptosis y autofagia. Los APL, especialmente la perifosina, aumentaron la masa mitocondrial mientras que los niveles de complejos OXPHOS disminuyeron sin afectar la tasa total de consumo de oxígeno. Además, observamos un aumento en los niveles de piruvato deshidrogenasa (PDH) y deshidrogenasa isocitrato (IDH) y una disminución en la actividad de deshidrogenasa láctica (LDH), lo que sugiere una reconfiguración metabólica inducida por la perifosina. Estas alteraciones llevaron a un mayor potencial de membrana mitocondrial, que se potenció por la disminución de los niveles de proteína desacoplante 2 (UCP2) y el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). En consecuencia, la perifosina indujo un desequilibrio en la función mitocondrial, resultando en una mayor producción de ROS que, en última instancia, impactó la viabilidad celular.