Los residuos de histidina desempeñan roles cruciales en la conformación de la función y estructura de las proteínas debido a su capacidad única para actuar como ácidos y bases. En otras palabras, pueden servir como donadores y aceptores de protones a pH fisiológico. Esta propiedad excepcional se atribuye al anillo de imidazol de los residuos de histidina. En consecuencia, determinar la constante de disociación ácido-base (pKa) de los anillos de imidazol de histidina en proteínas a menudo proporciona valiosos conocimientos sobre las funciones de las proteínas. Se han dedicado esfuerzos significativos a medir los valores de pKa de los residuos de histidina en diversas proteínas, siendo la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) la técnica más utilizada. Sin embargo, los métodos basados en RMN enfrentan desafíos para asignar señales a anillos de imidazol individuales y requieren una cantidad sustancial de proteínas. Para abordar estos problemas asociados con los enfoques basados en RMN, se ha desarrollado un método basado en espectrometría de masas conocido como espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio de histidina (His-HDX-MS). Esta técnica no solo determina los valores de pKa de los grupos de imidazol de histidina, sino que también cuantifica su accesibilidad al solvente. His-HDX-MS ha demostrado ser efectiva en diversas proteínas, mostrando su utilidad. Esta revisión tiene como objetivo aclarar los principios fundamentales de His-HDX-MS, detallar el flujo de trabajo experimental, explicar los procedimientos de análisis de datos y proporcionar orientación para interpretar los resultados obtenidos.