Los humedales costeros están altamente amenazados por las actividades humanas, lo que lleva a la degradación de la calidad del agua y la pérdida de biodiversidad. Este estudio evaluó la variación espacial en 27 parámetros de calidad del agua, materia orgánica en sedimentos y ensamblajes de macroinvertebrados en 12 sitios del humedal estuarino del río Cruces (sitio Ramsar CRW, sur de Chile) durante el verano de 2019. Nuestro análisis identificó tres áreas de estaciones de muestreo en el humedal, categorizadas por gradiente trófico y salinidad: agua dulce (n = 5), mixta (n = 3) y estuario (n = 4). Los sitios de agua dulce se caracterizaron por baja salinidad, turbidez y altas concentraciones de nitratos. Los sitios estuarinos se caracterizaron por salinidades y turbideces más altas y bajas concentraciones de nitratos y carbono orgánico total (COT), y los sitios mixtos tenían bajas salinidades, altas turbideces, alto COT y bajos nitratos. A lo largo del CRW, se registraron la riqueza y densidades de diferentes invertebrados. Las estaciones de agua dulce tenían mayor riqueza de especies, y las estaciones de estuario tenían mayor abundancia. Los macroinvertebrados encontrados en los tramos inferiores del CRW incluían especies características de ambientes estuarinos, mientras que las estaciones superiores estaban dominadas por invertebrados que habitan en ambientes de baja salinidad. Según el gráfico de ordenación del análisis de redundancia basado en distancias (dbRDA) y el modelo lineal basado en distancias (DistLM), nuestros resultados indican que los ensamblajes de macroinvertebrados difieren significativamente entre las áreas del CRW, principalmente debido a variables fisicoquímicas (es decir, salinidad, carbono total y fósforo disuelto). El contenido total de materia orgánica en los sedimentos fue mayor en los sitios de agua dulce y menor en los sitios estuarinos. Nuestros hallazgos se utilizarán para monitorear el humedal e implementar medidas de gestión adecuadas para las actividades humanas, protegiendo y conservando así el humedal estuarino del río Cruces Ramsar.