La ribozima ligasa de clase I consta de 121 nucleótidos y muestra una alta tasa catalítica comparable a la que se encuentra en las polimerasas proteicas naturales. En este estudio, nuestro objetivo fue identificar la unidad activa más pequeña de la ribozima ligasa de clase I que comprende aproximadamente 50 nucleótidos, comparable a la longitud estimada del ARN sintetizado prebióticamente. Basándonos en la estructura tridimensional de la ribozima ligasa de clase I, se prepararon mutantes y se analizaron sus actividades de ligación. Se mantuvo una actividad de ligación suficiente incluso al acortarse a 94 nucleótidos. Sin embargo, dado que sería difícil acercarse al objetivo de aproximadamente 50 nucleótidos eliminando solo la estructura parcial, la ribozima ligasa de clase I se dividió en dos moléculas. La actividad de ligación se mantuvo incluso al dividirse en dos moléculas de 55 y 39 nucleótidos. Utilizando un sistema con ribozimas divididas similares, analizamos la actividad de ligación de los mutantes C30, C47 y A71, que se han identificado previamente como las posiciones que contribuyen a la actividad catalítica, y discutimos la base estructural de la actividad de estas bases. Nuestros hallazgos sugieren la justificación para el ensamblaje de la ribozima ligasa de clase I a partir de múltiples fragmentos que sería alcanzable con la síntesis prebiótica.