Resumen

El presente estudio se llevó a cabo para evaluar diferentes métodos de bioseparación orientados a la recuperación de exopoligalacturonasas (exo-PG) y endopoligalacturonasas (endo-PG) contenidas en el extracto enzimático procedente de la fermentación en medio semisólido de Aspergillus niger utilizando cáscara de naranja para la preparación de los sustratos. El producto de fermentación fue sometido a un pretratamiento que involucró una fase de extracción sólido–líquido utilizando solución 0.1 M de metabisulfito de sodio y encontrándose mediante la implementación de un diseño de experimentos unifactorial completamente aleatorizado que la relación producto de fermentación – solvente que maximizó la concentración de proteínas y la actividad enzimática fue 1:4. La etapa de pretratamiento involucró además un proceso de centrifugación a 4500 rpm a 4 ˚C durante 30 min y un proceso de microfiltración con membrana de nitrocelulosa de 0.45 μm, reportándose factores de purificación de 1.96 y 1.75 para la exo-PG y la endo-PG respectivamente. Los métodos de precipitación por salado y por punto isoeléctrico fueron evaluados de manera independiente, determinándose que los pellets resuspendidos en buffer acetato 0.1 M y pH 4.5 presentan una mayor actividad endo-PG cuando son obtenidos al ajustar el extracto enzimático pretratado a un 80% de saturación de sal, empleando solución 4 M de sulfato de amonio; por otro lado, se encontró que las enzimas pectinolíticas de interés se caracterizan por presentar un rango de estabilidad a valores de pH entre 3.0 y 6.0, intervalo por fuera del cual la actividad enzimática disminuía hasta perderse. Ante la sensibilidad que presentaron los métodos de cuantificación de actividad enzimática cuando la proteína total de las muestras analizadas se encontraba muy diluida, se definió utilizar sulfato de amonio en estado sólido para implementar una prueba que acopló los dos métodos de precipitación anteriormente mencionados, derivando en un factor de purificación de 1.79 y de 1.17 para la exo-PG y endo-PG respectivamente que se explican por el efecto de concentración que tomó lugar en la fase de resuspensión de los precipitados en el buffer acetato. El proceso de ultrafiltración fue implementado en el Sistema de Ultrafiltración marca Millipore, modelo Pellicon 2, utilizando una membrana de peso molecular de corte (MWCO) de 30 kDa y alcanzando para la exo-PG y la endo-PG factores de purificación respectivos de 1.39 y 1.14. Por otro lado, la extracción líquido–líquido mediante el sistema de bifases acuosas conformado por polietilenglicol de peso molecular 4000 (13% w/w) y buffer fosfato (28% w/w) derivó en un factor de purificación de 1.11 para la enzima endo-PG. 11 Finalmente, y con base en todos estos resultados, se sugiere una integración de procesos downstream que derive en factores de purificación mayores para las enzimas pectinolíticas de interés. La ruta de purificación en cuestión involucra la precipitación por salado utilizando sulfato de amonio en estado sólido para ajustar el producto de fermentación pretratado a un 80% de saturación, la resuspensión de los pellets en un volumen de buffer equivalente a ¼ del volumen del extracto enzimático inicial y, por último, el paso de la resuspensión obtenida por membrana de ultrafiltración de 30 kDa.

• Materias:Biotecnología Enzimas Extracción (Química) Fermentación Tecnología
• Subjects:Biotechnology Enzymes Extraction (Chemistry) Fermentation Technology
• Palabras claves:bioseparación, Aspergillus niger, enzimas pécticas
• Keywords:bioseparation, Aspergillus niger, pectic enzymes