La preservación de bacterias es asunto de gran importancia debido a que muchas de ellas son usadas en procesos biotecnológicos que requieren mantener su viabilidad y propiedades genéticas. En este estudio, se evaluaron tres métodos para la preservación de A. chroococcum C26 y A. vinelandii C27; criopreservación, liofilización, e inmovilización en polímeros secos, durante 60, 30 y 60 días, respectivamente. A su vez, se estudió el efecto de tres agentes protectivos para la liofilización y para la criopreservación y cuatro polímeros. La eficiencia de los métodos fue evaluada contando células viables y midiendo actividad como fijación de nitrógeno. Los resultados mostraron que la mejor técnica, la cual mantuvo la viabilidad y la actividad, fue la liofilización, seguida por inmovilización y criopreservación. La liofilización mantuvo estable la habilidad bacteriana para fijar nitrógeno, la tasa de sobrevivencia bacteriana (TSB) fue superior al 80%; y el mejor resultado se evidenció cuando se usó S/BSA como agente protectivo. La inmovilización mantuvo la BSR superior al 80%, y la fijación de nitrógeno fue disminuida en 20%. La criopreservación tuvo pérdida sustancial de viabilidad para C26 (TSB aprox. 70%); mientras que C27 se preservó bien. La fijación de nitrógeno fue significativamente disminuida para ambas cepas independientemente del agente crioprotectivo usado (P < 0.05). Los resultados sugieren que el éxito de los métodos de preservación para Azotobacter depende de la técnica, el agente protectivo y la cepa usada; siendo la liofilización con S/BSA la técnica con mejores resultados para preservar las bacterias de este género.