Imagen. / MIT

Basándose en el sistema de edición de genes CRISPR, los investigadores del MIT han diseñado una nueva herramienta que puede eliminar genes defectuosos y reemplazarlos por otros nuevos, de una manera más segura y eficiente.

Usando este sistema, los investigadores demostraron que podían entregar genes de hasta 36.000 pares de bases de ADN a varios tipos de células humanas, así como a células hepáticas en ratones. La nueva técnica, conocida como PASTE, podría resultar prometedora para el tratamiento de enfermedades causadas por genes defectuosos con una gran cantidad de mutaciones, como la fibrosis quística.

"Es una nueva forma genética de atacar potencialmente estas enfermedades realmente difíciles de tratar", dice Omar Abudayyeh, miembro de McGovern en el Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT. “Queríamos trabajar en lo que se suponía que debía hacer la terapia génica en su inicio original, que es reemplazar genes, no solo corregir mutaciones individuales”.

La nueva herramienta combina la orientación precisa de CRISPR-Cas9, un conjunto de moléculas originalmente derivadas de los sistemas de defensa bacterianos, con enzimas llamadas integrasas, que los virus utilizan para insertar su propio material genético en un genoma bacteriano.

“Al igual que CRISPR, estas integrasas provienen de la batalla en curso entre las bacterias y los virus que las infectan”, dice Jonathan Gootenberg, también miembro de McGovern. "Habla de cómo podemos seguir encontrando una gran cantidad de nuevas herramientas interesantes y útiles de estos sistemas naturales".

Gootenberg y Abudayyeh son los autores principales del nuevo estudio, que aparece hoy en Nature Biotechnology . Los autores principales del estudio son los asociados técnicos del MIT Matthew Yarnall y Rohan Krajeski, la exestudiante de posgrado del MIT Eleonora Ioannidi y el estudiante de posgrado del MIT Cian Schmitt-Ulms.

inserción de ADN

El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 consiste en una enzima de corte de ADN llamada Cas9 y una cadena corta de ARN que guía a la enzima a un área específica del genoma, dirigiendo a Cas9 hacia dónde hacer su corte. Cuando Cas9 y el ARN guía que se dirige a un gen de la enfermedad se introducen en las células, se realiza un corte específico en el genoma y los procesos de reparación del ADN de las células vuelven a pegar el corte, a menudo eliminando una pequeña porción del genoma.

Si también se entrega una plantilla de ADN, las células pueden incorporar una copia corregida en sus genomas durante el proceso de reparación. Sin embargo, este proceso requiere que las células hagan rupturas de doble cadena en su ADN, lo que puede causar deleciones o reordenamientos cromosómicos que son perjudiciales para las células. Otra limitación es que solo funciona en células que se están dividiendo, ya que las células que no se dividen no tienen procesos activos de reparación del ADN.

El equipo del MIT quería desarrollar una herramienta que pudiera eliminar un gen defectuoso y reemplazarlo por uno nuevo sin inducir roturas de ADN de doble cadena. Para lograr este objetivo, recurrieron a una familia de enzimas llamadas integrasas, que los virus llamados bacteriófagos utilizan para insertarse en los genomas bacterianos.

Para este estudio, los investigadores se centraron en las serina integrasas, que pueden insertar enormes fragmentos de ADN, de hasta 50.000 pares de bases. Estas enzimas se dirigen a secuencias genómicas específicas conocidas como sitios de unión, que funcionan como "plataformas de aterrizaje". Cuando encuentran la plataforma de aterrizaje correcta en el genoma del huésped, se unen a ella e integran su carga útil de ADN.

En trabajos anteriores, a los científicos les resultó difícil desarrollar estas enzimas para la terapia humana porque las plataformas de aterrizaje son muy específicas y es difícil reprogramar las integrasas para que se dirijan a otros sitios. El equipo del MIT se dio cuenta de que la combinación de estas enzimas con un sistema CRISPR-Cas9 que inserta el sitio de aterrizaje correcto permitiría reprogramar fácilmente el poderoso sistema de inserción.

La nueva herramienta, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), incluye una enzima Cas9 que corta en un sitio genómico específico, guiada por una hebra de ARN que se une a ese sitio. Esto les permite apuntar a cualquier sitio del genoma para la inserción del sitio de aterrizaje, que contiene 46 pares de bases de ADN. Esta inserción se puede realizar sin introducir rupturas de doble cadena agregando primero una cadena de ADN a través de una transcriptasa inversa fusionada y luego su cadena complementaria.

Una vez que se incorpora el sitio de aterrizaje, la integrasa puede aparecer e insertar su carga útil de ADN mucho más grande en el genoma en ese sitio. 

“Creemos que este es un gran paso para lograr el sueño de la inserción programable de ADN”, dice Gootenberg. “Es una técnica que se puede adaptar fácilmente tanto al sitio que queremos integrar como a la carga”.

Reemplazo de genes

En este estudio, los investigadores demostraron que podían usar PASTE para insertar genes en varios tipos de células humanas, incluidas las células hepáticas, las células T y los linfoblastos (glóbulos blancos inmaduros). Probaron el sistema de entrega con 13 genes de carga útil diferentes, incluidos algunos que podrían ser útiles desde el punto de vista terapéutico, y pudieron insertarlos en nueve ubicaciones diferentes del genoma.

En estas células, los investigadores pudieron insertar genes con una tasa de éxito que oscilaba entre el 5 y el 60 por ciento. Este enfoque también produjo muy pocos "indels" no deseados (inserciones o eliminaciones) en los sitios de integración de genes.

“Vemos muy pocos indeles, y debido a que no estamos haciendo rupturas de doble cadena, no tiene que preocuparse por los reordenamientos cromosómicos o las eliminaciones de brazos cromosómicos a gran escala”, dice Abudayyeh.

Los investigadores también demostraron que podían insertar genes en hígados “humanizados” en ratones. Los hígados de estos ratones consisten en alrededor del 70 por ciento de hepatocitos humanos, y PASTE integró con éxito nuevos genes en alrededor del 2,5 por ciento de estas células.

Las secuencias de ADN que los investigadores insertaron en este estudio tenían una longitud de hasta 36.000 pares de bases, pero creen que también podrían usarse secuencias más largas. Un gen humano puede tener desde unos pocos cientos hasta más de 2 millones de pares de bases, aunque con fines terapéuticos solo se necesita usar la secuencia codificante de la proteína, lo que reduce drásticamente el tamaño del segmento de ADN que se debe insertar en el genoma.

“La capacidad de realizar grandes integraciones genómicas específicas del sitio es de gran valor tanto para los estudios de ciencia básica como de biotecnología. Anticipo que este conjunto de herramientas será muy útil para la comunidad investigadora”, dice Prashant Mali, profesor de bioingeniería en la Universidad de California en San Diego, que no participó en el estudio.

Los investigadores ahora están explorando más a fondo la posibilidad de utilizar esta herramienta como una posible forma de reemplazar el gen defectuoso de la fibrosis quística. Esta técnica también podría ser útil para tratar enfermedades de la sangre causadas por genes defectuosos, como la hemofilia y la deficiencia de G6PD, o la enfermedad de Huntington, un trastorno neurológico causado por un gen defectuoso que tiene demasiadas repeticiones genéticas.

Los investigadores también han hecho que sus construcciones genéticas estén disponibles en línea para que otros científicos las usen.

“Una de las cosas fantásticas de la ingeniería de estas tecnologías moleculares es que las personas pueden desarrollarlas, desarrollarlas y aplicarlas de maneras que tal vez no pensamos o no habíamos considerado”, dice Gootenberg. “Es realmente genial ser parte de esa comunidad emergente”.

La investigación fue financiada por una beca de movilidad posdoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza, los Institutos Nacionales de Salud de EE. Y. Mathers Charitable Foundation, MIT John W. Jarve Seed Fund for Science Innovation, Impetus Grants, Cystic Fibrosis Foundation Pioneer Grant, Google Ventures, Fast Grants, Harvey Family Foundation y McGovern Institute.

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