La propagación in vitro efectiva de plantas medicinales y aromáticas a menudo está limitada por la elección de fuentes óptimas de citoquininas, que son críticas para la proliferación exitosa de brotes y la regeneración general. Desde su descubrimiento, los topolinas han sido reconocidos como alternativas a las citoquininas tradicionales (CKs) como la benziladenina (BA) y la kinetina (Kin) en el cultivo de tejidos vegetales (PTC). Este estudio investigó la influencia de tres CKs aromáticas (topolina (T), BA y Kin) en la proliferación de brotes de tomillo, con el objetivo de mejorar los protocolos actuales de PTC. De todos los tratamientos probados, la mayor proliferación de brotes (7.25 +/- 0.72 brotes por explante nodal) se observó en el tratamiento con 1 uM T, superior a BA y Kin. Aumentar las concentraciones de T y BA de 1 a 15 uM tuvo un efecto inverso en la producción de brotes. La adición de ácido indol-3-butírico (IBA) a concentraciones que oscilan entre 1.0 y 5.0 uM en combinación con 0.5 y 1 uM T no aumentó el número medio de brotes por explante. Los brotes regenerados mostraron una fuerte propensión al desarrollo de raíces incluso en ausencia de reguladores del crecimiento vegetal con un 100% de supervivencia ex vitro. Este estudio demostró que T es una alternativa efectiva, sostenible y rentable a las CKs tradicionales para la propagación in vitro, logrando una mejor proliferación de brotes con la aplicación de 1 M T.