Este estudio tiene como objetivo evaluar la posible actividad anticancerígena del aceite esencial de hierba de limón (LEO) utilizando métodos in vitro e in silico. La destilación por vapor de las partes aéreas produjo un 3.2% (p/p) de LEO. El análisis de GC-MS del LEO reveló la presencia de alfa-citral (37.44%), beta-citral (36.06%), acetato de linalool (9.82%) y d-limoneno (7.05%) como componentes principales, acompañados de varios otros compuestos menores. La actividad antioxidante, evaluada mediante el ensayo DPPH, reveló que el LEO exhibe un valor de IC de 92.30 g/mL. El efecto citotóxico del LEO, así como del LEO solubilizado con Tween-20 (LEO-Tw) y PEG-400 (LEO-PEG), contra una serie de líneas celulares cancerosas (A375, RPMI-7951, MCF-7 y HT-29) se evaluó utilizando el ensayo Alamar Blue; los resultados revelaron un alto efecto citotóxico contra todas las líneas celulares utilizadas en este estudio. Además, ninguna de las concentraciones probadas de LEO, LEO-PG o LEO-TW afectó significativamente la viabilidad de las células sanas HaCaT, mostrando así características de selectividad prometedoras. Además, el LEO, LEO-PG y LEO-TW aumentaron la producción de ROS y disminuyeron el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en todas las líneas celulares cancerosas. Además, el tratamiento con LEO disminuyó todas las tasas respiratorias mitocondriales, sugiriendo así su capacidad para inducir un deterioro de la función mitocondrial. Los estudios de acoplamiento molecular revelaron que la actividad anticancerígena del LEO, entre otros mecanismos, podría atribuirse a PDK1 y PI3Kalpha, donde los principales contribuyentes se encuentran entre los componentes menores del aceite esencial. El inhibidor teórico más activo contra ambas proteínas fue el óxido de beta-cariofileno.