La senescencia foliar es un proceso de desarrollo que permite la remobilización y el transporte de nutrientes a los órganos sumideros. Anteriormente, se ha encontrado que las proteasas de cisteína similares a la papaína (PLCPs) están altamente expresadas durante la senescencia foliar en diferentes especies de plantas. En este estudio, analizamos las PLCPs activas en hojas de cebada (Hordeum vulgare) durante la etapa terminal de la senescencia natural. La cromatografía de intercambio aniónico de extractos de proteínas de hojas de cebada, cosechadas seis semanas después de la antesis, seguida de ensayos de actividad utilizando los sustratos Z-FR-AMC y Z-RR-AMC, reveló un único pico prominente correspondiente a las PLCPs activas. Esta actividad hidrolítica fue completamente inhibida por E-64, un potente e irreversible inhibidor de las proteasas de cisteína. Las fracciones enriquecidas en actividad de PLCP fueron etiquetadas por afinidad con DCG-04 y sometidas a fraccionamiento por SDS-PAGE, separando dos bandas principales a 43 y 38 kDa. Estas bandas fueron analizadas mediante espectrometría de masas en tándem, lo que permitió la identificación de once PLCPs. Las enzimas identificadas pertenecen a ocho subfamilias de PLCP, incluyendo CTB/similar a la catepsina B (Pap-19 y -20), RD19/similar a la catepsina F (Pap-1), ALP/similar a la catepsina H (Pap-12 o aleuraina), SAG12/similar a la catepsina L A (Pap-17), CEP/similar a la catepsina L B (Pap-14), RD21/similar a la catepsina L D (Pap-6 y -7), similar a la catepsina L E (Pap-13 y -16), y XBCP3 (Pap-8). Entre las PLCPs identificadas, Pap-6 fue la más abundante. Se identificaron péptidos correspondientes a Pap-6 en ambas bandas de 43 kDa y 38 kDa en aproximadamente la misma cantidad basada en el conteo espectral total. Así, nuestros resultados indican que se pueden aislar dos isoformas activas de Pap-6 de las hojas de cebada en la senescencia tardía.