El almidón resistente (RS) muestra varios beneficios para la salud. Mejorar el contenido de RS en el trigo es de gran importancia comercial. Sin embargo, el conocimiento sobre el mecanismo de síntesis de RS en el trigo sigue siendo limitado. En este estudio, se investigó la acumulación dinámica de RS durante el proceso de llenado en dos genotipos de trigo (L.) con contenidos contrastantes de RS (H242, alto contenido de RS; H189, bajo contenido de RS). Los resultados demuestran que más allá de los 25 días después de la polinización (DAP), el contenido de RS de H189 fue relativamente estable, pero el de H242 continuó aumentando. Se observó una acumulación secundaria en el genotipo de trigo de alto contenido de RS. Un análisis comparativo del transcriptoma entre H242 y H189 a 20 DAP y 35 DAP mostró que los genes diferencialmente expresados estaban principalmente involucrados en el metabolismo de los glicéridos, metabolismo de los glicerofosfolípidos e interconversiones de glucuronato. Además, el análisis de la red de coexpresión génica ponderada sugirió que las vías metabólicas de lípidos como la vía del metabolismo de los glicerofosfolípidos podrían estar involucradas en la síntesis de RS, y que los genes relacionados con lípidos regulados al alza más allá de los 25 DAP resultaron en la acumulación secundaria de RS. Este trabajo proporciona información sobre las características y los mecanismos de síntesis de RS.