El análisis de cariotipos y la investigación de variaciones cromosómicas son desafiantes debido a sus cromosomas pequeños y morfológicamente similares. A pesar de su utilidad en la identificación de cromosomas y la investigación evolutiva de cariotipos, el ADN satélite (satDNA) sigue siendo poco utilizado. En el presente estudio, se identificaron 12 satDNAs, y se analizaron bioinformáticamente los números de copias y las distribuciones cromosómicas de cada satDNA en los genomas de referencia. Se desarrollaron y validaron con éxito diez sondas de satDNA para hibridación fluorescente in situ (FISH) en los cromosomas de un híbrido de álamo. Al integrar los patrones de distribución de satDNA genómico bioinformático con las señales experimentales de FISH, construimos un cariotipo molecular. El análisis comparativo reveló errores en las ensamblajes actuales del genoma de álamo. El análisis comparativo de cariotipos de las líneas haploides duplicadas (DH) reveló variaciones cromosómicas en las líneas DH en relación con el árbol donante. Los resultados demuestran que las sondas de satDNA recién desarrolladas constituyen herramientas citogenéticas robustas para detectar variaciones estructurales, mientras que el cariotipado molecular proporciona nuevas perspectivas sobre los mecanismos genéticos subyacentes a las variaciones cromosómicas en las plantas DH derivadas.