En este estudio, se desarrolló un método basado en extracción en fase sólida de fibra empacada (PFSPE) para detectar simultáneamente nueve quinolonas, incluyendo enrofloxacino (ENR), ciprofloxacino (CIP), ofloxacino (OFL), pefloxacino (PEF), lomefloxacino (LOM), norfloxacino (NOR), sarafloxacino (SAR), danofloxacino (DAN) y difloxacino (DIF), en leche pura, utilizando cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS). El poliestireno (PS) y el poliacrilonitrilo (PAN) se combinaron para formar nanofibras compuestas PS-PAN mediante electrohilado. Las nanofibras se utilizaron para preparar las columnas de extracción caseras, y el proceso se optimizó y validó utilizando leche pura en blanco. El método analítico mostró una alta precisión, y las recuperaciones fueron del 88.68 al 97.63%. Las desviaciones estándar relativas intra-día e inter-día estuvieron en los rangos de 1.11-6.77% y 2.26-7.17%, respectivamente. Además, el método desarrollado mostró una buena linealidad (R >= 0.995) y bajos límites de cuantificación del método para las nueve quinolonas (entre 1.0-100 ng/mL) para todas las muestras estudiadas. Las nueve quinolonas en la matriz compleja fueron extraídas directamente utilizando 4.0 mg de nanofibras compuestas PS-PAN como sorbente y completamente eluidas en 100 L de disolvente de elución. Por lo tanto, el PFSPE-HPLC-MS/MS desarrollado es una técnica sensible y rentable que puede detectar y controlar eficazmente nueve quinolonas en productos lácteos.