Se ha investigado extensamente la nutrición de aminoácidos para ponedoras durante las últimas cinco décadas, pero los estudios han utilizado una única fuente de triptófano suplementario, L-triptófano 98%. La biodisponibilidad es un aspecto crucial de la utilización de nutrientes, que abarca los procesos de digestión, absorción, metabolismo y utilización del nutriente. Esta investigación se llevó a cabo para evaluar la bioequivalencia y determinar el valor de biodisponibilidad relativa (RBV) de la biomasa de L-triptófano 60% para gallinas ponedoras comerciales Hy-Line Brown. Se realizaron dos ensayos utilizando un diseño experimental completamente aleatorizado. El primer ensayo utilizó un método de comparación directa. Un total de 66 ponedoras se distribuyeron en dos tratamientos y 11 réplicas, con 3 aves por réplica, totalizando 21 unidades experimentales. El segundo ensayo utilizó el método de razón de pendiente. Un total de 150 ponedoras se distribuyeron de tal manera que hubo cinco tratamientos y diez réplicas de tres gallinas, totalizando 50 unidades experimentales. Se evaluaron el rendimiento, la calidad del huevo y la composición corporal. Los resultados obtenidos con el método de comparación directa no mostraron diferencias significativas (> 0.05) entre la biomasa de L-triptófano 60% y L-triptófano 98%. Entre las variables de composición corporal, solo los lípidos corporales mostraron un efecto significativo (< 0.05). De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó que el RBV de la biomasa de L-triptófano 60% era del 100% en relación con L-triptófano 98%. Así, la biomasa de L-triptófano 60% es bioequivalente y igualmente biodisponible que L-triptófano 98%.