El Genome Walking (GW) comprende una serie de métodos basados en PCR para la identificación de secuencias de nucleótidos que flanquean regiones conocidas. Los diferentes métodos se han utilizado para varios propósitos: desde la secuenciación, útil para la identificación de regiones desconocidas, hasta la caracterización de sitios de inserción para virus y transposones. En estos últimos casos, los métodos de Genome Walking se han visto recientemente potenciados al acoplarse a tecnologías de Secuenciación de Nueva Generación. Esta revisión se centrará en el desarrollo de varios protocolos para la aplicación de tecnologías de Secuenciación de Nueva Generación (NGS) al GW, que se han desarrollado en el transcurso del análisis de bibliotecas de inserción. Estos análisis encuentran una amplia aplicación en protocolos para la genómica funcional y la terapia génica. Gracias a la aplicación de tecnologías NGS, la visión original del GW como un procedimiento para caminar a lo largo de un genoma desconocido está cambiando hacia la posibilidad de observar la marcha paralela de cientos de miles de cebadores a través de las fronteras de las moléculas de ADN insertadas en los genomas de los hospedadores.