El brócoli contiene diversos fitonutrientes, incluidos los glucosinolatos y sus productos de hidrólisis, con potenciales propiedades nutricionales y bioactivas. Un perfil metabólico preciso requiere una preparación de muestra optimizada y bases de datos completas. Se evaluó un método rápido de desactivación enzimática con metanol al 70%, implementado antes de la criomolienda, para procesar floretes de brócoli liofilizados y frescos, que se compararon como materiales vegetales. Se construyó una base de datos de metabolitos ampliamente dirigida y resuelta por órganos integrando más de 612 fitonutrientes reportados con productos de degradación de glucosinolatos. Se empleó LC-HRMS combinado con MS-DIAL y GNPS para la detección y anotación de metabolitos. Las muestras liofilizadas produjeron casi el doble de glucosinolatos, isotiocianatos y nitrilos en comparación con el tejido fresco procesado de manera estándar. El pretratamiento con metanol preservó la integridad de los metabolitos en muestras frescas, logrando una sensibilidad comparable al material liofilizado. Usando la base de datos integrada, se identificaron o caracterizaron tentativamente 998 metabolitos, incluidos aminoácidos, ácidos carboxílicos, fenoles, alcaloides, terpenoides y derivados de glucosinolatos. Se mejoró la reproducibilidad entre plataformas y se redujeron los falsos positivos. La preparación de muestras optimizada combinada con una base de datos de metabolitos curada permite un perfilado integral y de alta confianza de los fitonutrientes de los floretes de brócoli. El conjunto de datos resultante proporciona una referencia valiosa para estudios sobre interacciones genotipo-ambiente, calidad nutricional y bioactividad funcional de las verduras crucíferas.