La planta medicinal produce mogrosidos de tipo cucurbitano de sabor dulce a partir del precursor triterpenoide atípico 2,3,22,23-dioxidosqualeno (SDO), en lugar del convencional 2,3-oxidosqualeno (SQO). Sin embargo, la formación de SDO en la biosíntesis de mogrosidos sigue siendo poco clara. Aquí, caracterizamos sistemáticamente dos epoxidazas de esqualeno (SgSQE1/2) a través de análisis filogenético, expresión heteróloga, localización subcelular, qRT-PCR y estudios de escaneo de alanina. Tanto SQE1 como SQE2 exhibieron actividad de epoxidaza de esqualeno, siendo SQE2 quien cataliza la formación de SDO en levaduras. Identificamos dos residuos catalíticos críticos que rigen la eficiencia de epoxidación a través de mutagénesis. Ambas SQEs se localizaron en el RE, mientras que el perfil de expresión reveló una tendencia similar entre la expresión y la acumulación de mogrosidos en los frutos. En nuestro estudio, desarrollamos una estrategia de ingeniería genómica para la caracterización heteróloga de SQE. Estos resultados sientan las bases para la reacción catalítica de SQE involucrada en la biosíntesis de mogrosidos y proporcionan recursos genéticos y un enfoque viable para la ingeniería metabólica de triterpenos.