Un ambiente de alta salinidad afecta seriamente el metabolismo fisiológico y el rendimiento de las plantas. Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link tiene una alta biomasa y valores ecológicos, alimentarios y económicos importantes, pero sus condiciones de crecimiento tienen seriosos efectos de sal y alcalinidad. La familia de genes NHX juega un papel vital en la regulación del equilibrio intracelular de Na+/K+, la homeostasis del pH y el transporte de vesículas y proteínas en las plantas. En este estudio, se clonó el gen HbNHX2 de Hordeum brevisubulatum y se caracterizó funcionalmente a través de análisis fenotípicos, fisiológicos y moleculares en tabaco transgénico. El perfil de expresión reveló que HbNHX2 era más abundante en espigas y menos abundante en puntas de raíces, y el nivel de expresión se indujo significativamente bajo estrés salino. La sobreexpresión de HbNHX2 condujo a una disminución de los niveles de malondialdehído (MDA) y aniones superóxido (O2-), mientras que mejoró las actividades de la superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa (POD) y catalasa (CAT). Además, los niveles de glutatión (GSH), proteínas solubles, prolina y clorofila también aumentaron. Varios genes responsables de la respuesta al estrés, incluidos CBL1, ERF2, BI-1, Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, POD, GR1, KC1, TPK1, TIP, P5CS, BAS1, STN7 y LTP1, se regulaban significativamente al alza, mientras que SERK3B se regulaba a la baja. Estos hallazgos sugieren que HbNHX2 mejora la tolerancia de las plantas a la sal al mantener el equilibrio osmótico, eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS) y regular la expresión de genes responsables de la respuesta al estrés. Este estudio proporciona nuevas perspectivas sobre el mecanismo molecular de la tolerancia a la sal en Hordeum brevisubulatum y sienta las bases para la cría de cultivos forrajeros tolerantes a la sal.