(1) Antecedentes: La preparación del conducto radicular constituye un factor importante para el éxito en endodoncia. Sin embargo, pueden ocurrir diversas complicaciones durante esta etapa. El objetivo de este estudio fue comparar la incidencia de fisuras en la dentina radicular después de la instrumentación con ProTaper Next (PTN), WaveOne Gold (WOG) y Twisted Files (TF), que utilizan diferentes cinemáticas. (2) Métodos: Ochenta dientes de raíz única fueron clasificados en cuatro grupos (n = 20). Tres grupos fueron instrumentados utilizando PTN (X1, X2), WOG (Primario) y TF (SM1-3). El grupo no instrumentado constituyó el grupo de control. Después de la preparación, las raíces fueron seccionadas a 3, 6 y 9 mm del ápice utilizando una sierra de baja velocidad (Southbay Technology Inc., San Clemente, CA, EE. UU.). Las muestras fueron observadas a través de un microscopio a 25x de magnificación (Leica M320, Wetzlar, Alemania), y su superficie fue evaluada táctilmente para determinar la presencia de fisuras. (3) Resultados: Se observaron fisuras parciales en la dentina radicular en todos los grupos del estudio (PTN: n = 4/20%, WOG: n = 3/15%, TF: n = 4/20%); no se observaron fisuras en el grupo de control. No se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales. Los valores de OR para la incidencia de fisuras fueron: OR = 11.182 para PTN, OR = 8.2 para WOG y OR = 8.2 para TF. (4) Conclusiones: La instrumentación con PTN, WOG y TF puede resultar en la formación de fisuras dentinales.