El diagnóstico de hipotiroidismo primario en perros se confirma por un nivel reducido de tiroxina total en suero (TT4) o tiroxina libre (FT4) asociado con un nivel elevado de hormona estimulante de tiroides en suero (TSH). Para formular un diagnóstico, además de una correcta evaluación de la historia clínica, el examen físico directo y el perfil hemato-bioquímico, es importante una medición precisa de la concentración sérica de hormonas tiroideas. El objetivo de este estudio es evaluar FT4 en perros sospechosos de hipotiroidismo comparando dos de las técnicas de ensayo más acreditadas en laboratorios veterinarios comunes: el inmunoensayo enzimático por quimioluminiscencia (CLEIA) y la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) precedida de ultrafiltración. Los resultados demuestran que CLEIA, que es más ventajosa y práctica desde un punto de vista económico, puede ser utilizada para el cribado, mientras que LC-MS/MS se recomienda para una evaluación más precisa de la función tiroidea en casos clínicos más complejos, como en perros con valores alterados de hormonas tiroideas. Se observó una correlación positiva significativa y estadística entre los valores de FT4 en sangre medidos por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem y quimioluminiscencia, tanto en sujetos con valores normales de FT4 y TSH como en el grupo de perros que presentaron estos valores alterados. Además, se observó una asociación negativa y significativa entre los valores de TSH y FT4 en sangre medidos con espectrometría de masas en tándem en el grupo de perros con valores hormonales atribuibles a hipotiroidismo.