El empalme alternativo (AS) es un mecanismo regulador post-transcripcional ampliamente reconocido que desempeña un papel crucial en la evolución de las plantas y la adaptación ambiental. En este estudio, se analizaron sistemáticamente cinco especies representativas para examinar la conservación evolutiva y las características funcionales de los eventos de AS. Los resultados revelaron una expansión en el número de eventos de AS y genes asociados en las especies, acompañada de un cambio a nivel genómico en los tipos de empalme, pasando de una dominancia de retención de intrones (IR) a un aumento en el salto de exones (ES), donantes alternativos (A5) y eventos de aceptores alternativos (A3). También se encontró que las preferencias de empalme divergían entre especies alotetraploides, que exhibieron patrones de AS más complejos. Las características genómicas de los eventos de IR y ES, como el contenido de GC y la longitud de la secuencia involucrada en AS, fueron altamente conservadas entre especies de diferentes niveles de ploidía (diploide vs. alotetraploide). Se identificaron genes que albergan eventos de IR conservados en las cinco especies, y la anotación funcional indicó que estos genes están principalmente involucrados en la modificación de la cromatina y procesos relacionados con el empalme de ARN. Este estudio elucida la remodelación dinámica del AS durante la evolución y proporciona importantes conocimientos sobre los mecanismos adaptativos evolutivos del AS en las plantas.