La preservación de células somáticas es una estrategia efectiva para conservar el potencial genético de especies en peligro de extinción. Para contribuir a la conservación del ciervo Milu, este estudio tuvo como objetivo establecer y caracterizar una línea celular inmortalizada de fibroblastos dérmicos (ML-iSFC). La línea celular se basa en fibroblastos del tejido dérmico de un cervatillo macho de ciervo Milu. Se determinaron las condiciones óptimas de cultivo mediante la suplementación del medio de cultivo con diferentes factores de crecimiento, y la inmortalización se logró a través de la transducción del antígeno T grande del virus simio 40 (SV40T). Las condiciones óptimas de cultivo para las células se determinaron añadiendo una variedad de factores de crecimiento. La morfología celular, las características de crecimiento y la expresión de marcadores de las células se evaluaron adicionalmente. El ciclo celular y la proliferación se evaluaron mediante citometría de flujo y ensayos CCK-8, respectivamente. Los cromosomas se determinaron mediante análisis de cariotipo. La tasa de crecimiento celular más alta se observó cuando el medio de cultivo se suplementó con 3 ng/mL de FGF2. El marcador específico de fibroblastos vimentina (VIM) se expresó tanto en ML-SFC como en ML-iSFC, mientras que el marcador epitelial queratina 18 (KRT18) se expresó débilmente en las células ML-SFC. El análisis de proliferación celular y del ciclo celular reveló que ML-iSFC exhibió una tasa de crecimiento más alta y mayor vitalidad en comparación con ML-SFC. El análisis de cariotipo mostró que ML-iSFC mantuvo el mismo número y morfología de cromosomas que ML-SFC. En resumen, este estudio informa sobre la construcción exitosa de una línea celular inmortalizada de fibroblastos del ciervo Milu, que servirá como una herramienta valiosa para la conservación del ciervo Milu.