La naturaleza heterogénea de los eyaculados resalta la relevancia de estudiar el comportamiento de diferentes subpoblaciones de espermatozoides. Los cambios en la motilidad de los espermatozoides y el aumento de la fosforilación de tirosina son eventos clave que suelen ocurrir durante la capacitación y pueden ser modificados por el proceso de criopreservación. Sin embargo, la relación entre ambos eventos sigue siendo poco definida a lo largo de la capacitación en las diferentes subpoblaciones de espermatozoides. Los espermatozoides frescos y descongelados fueron incubados en medios capacitantes (CAP) y no capacitantes (NC) hasta 240 minutos. La cinemática de los espermatozoides, la fosforilación de tirosina y la actividad mitocondrial fueron medidas mediante el sistema CASA y la citometría de flujo por imagen. Se identificaron cuatro subpoblaciones de espermatozoides móviles (SP) en el semen de carnero fresco y descongelado después del análisis de clúster. La incubación en condiciones de CAP a lo largo del tiempo llevó a mayores cambios en el porcentaje de espermatozoides incluidos en cada subpoblación en comparación con las condiciones de NC, siendo diferentes entre los espermatozoides frescos y descongelados. La SP1, caracterizada por espermatozoides lentos, aumentó progresivamente después de 15 minutos en muestras descongeladas incubadas en ambos medios, pero no en las frescas. La SP4, caracterizada por espermatozoides rápidos y no lineales, mostró un aumento marcado durante la CAP, pero no bajo condiciones de NC, ocurriendo más rápidamente en espermatozoides descongelados. Esta subpoblación (SP4) también fue la única que mostró una correlación positiva y fuerte con la actividad mitocondrial y todas las regiones de espermatozoides fosforiladas durante la capacitación, ya sea en muestras frescas o descongeladas. Nuestros resultados indicaron que la capacitación in vitro indujo cambios significativos en la distribución de subpoblaciones de espermatozoides móviles, siendo afectada por la criopreservación. No obstante, la subpoblación que probablemente representa espermatozoides similares a los hiperactivados (SP4) también aumentó en muestras descongeladas, ocurriendo más rápido y simultáneamente al incremento de la actividad mitocondrial y la fosforilación de tirosina de diferentes regiones de los espermatozoides.