Los sistemas CRISPR/Cas9 se utilizan comúnmente para la edición del genoma de plantas; sin embargo, la generación de líneas mutantes homocigotas sigue siendo un desafío. Aquí, presentamos un protocolo basado en CRISPR/Cas9 que permite la generación eficiente de mutantes. Se realizó la edición genética del gen de la quinasa receptora LysM y de dos genes de transportadores de la superfamilia de facilitadores mayoritarios. La funcionalidad de los vectores CRISPR/Cas9 se probó en hojas mediante la edición de un gen co-transformado. Los explantes de hoja transformados se regeneraron en plantas completas con alta eficiencia (80%). Se alcanzó una eficiencia de edición (frecuencia de mutaciones en un sitio objetivo dado) de hasta el 70% en las plantas regeneradas. Las plantas con mutaciones knockout fueron propagadas y se caracterizaron tres líneas mutantes homocigotas independientes. No se identificaron mutaciones fuera del objetivo en estos mutantes. Finalmente, se compararon los mutantes y las plantas tipo salvaje con respecto a la formación de nódulos radicales inducidos por bacterias fijadoras de nitrógeno. La formación de nódulos se retrasó considerablemente en las tres líneas mutantes. Sorprendentemente, el tamaño de los raros nódulos en las plantas mutantes fue mayor que en las plantas tipo salvaje. En conclusión, la caracterización simbiótica de los mutantes generados con el protocolo CRISPR/Cas9 desarrollado indicó un papel en la formación de nódulos.