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Desarrollo del sistema de knockout de genes múltiples con PCR de un solo paso en el crenarchaeon termoacidófilo Sulfolobus acidocaldarius

Los sistemas de knockout de múltiples genes desarrollados en el crenarqueón termoacidófilo Sulfolobus acidocaldarius son potentes herramientas genéticas. Sin embargo, la construcción de plásmidos suele requerir varios pasos. También se ha desarrollado en S. acidocaldarius la técnica de PCR tailing para la disrupción génica de alto rendimiento, pero el knockout génico repetido basado en PCR tailing ha sido limitado debido a la falta de un sistema de marcadores genéticos. En este estudio, demostramos una frecuencia de recombinación homóloga eficiente (2,8 × 104 ± 6,9 × 103 colonias/μg de ADN) mediante la optimización de las condiciones de transformación. Este protocolo optimizado permitió desarrollar un knockout génico fiable a través del doble cruce utilizando brazos homólogos cortos y establecer el sistema de knockout génico múltiple con PCR de un solo paso (MONSTER). En el MONSTER, un casete de knockout génico múltiple se construyó de forma sencilla y rápida mediante PCR de un solo paso sin necesidad de construir un plásmido, y el producto de la PCR puede utilizarse inmediatamente para la eliminación del gen diana. Como ejemplo de las aplicaciones de esta estrategia, hemos creado con éxito una cepa de S. acidocaldarius deficiente en ADN fotoliasa (phr-) y arginina descarboxilasa (argD-). Además, también se estableció un sistema de selección de agmatina consistente en una cepa agmatina-auxotrófica y un marcador argD. El MONSTER proporciona una estrategia alternativa que permite la construcción muy sencilla de casetes de eliminación de múltiples genes para estudios genéticos en S. acidocaldarius.

Autores: Shoji, Suzuki; Norio, Kurosawa

Idioma: Inglés

Editor: Hindawi

Año: 2017

Disponible con Suscripción Virtualpro

Artículos


Categoría

Ciencias Naturales y Subdisciplinas

Licencia

CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual

Consultas: 17

Citaciones: Sin citaciones


Hindawi

Archaea

Volume 2017, Article ID 7459310, 12 pages

https://doi.org/10.1155/2017/7459310

Shoji Suzuki, Norio Kurosawa

, Japan

Academic Editor: Sonja-Verena Albers

Contact: archaea@hindawi.com

Descripción
Los sistemas de knockout de múltiples genes desarrollados en el crenarqueón termoacidófilo Sulfolobus acidocaldarius son potentes herramientas genéticas. Sin embargo, la construcción de plásmidos suele requerir varios pasos. También se ha desarrollado en S. acidocaldarius la técnica de PCR tailing para la disrupción génica de alto rendimiento, pero el knockout génico repetido basado en PCR tailing ha sido limitado debido a la falta de un sistema de marcadores genéticos. En este estudio, demostramos una frecuencia de recombinación homóloga eficiente (2,8 × 104 ± 6,9 × 103 colonias/μg de ADN) mediante la optimización de las condiciones de transformación. Este protocolo optimizado permitió desarrollar un knockout génico fiable a través del doble cruce utilizando brazos homólogos cortos y establecer el sistema de knockout génico múltiple con PCR de un solo paso (MONSTER). En el MONSTER, un casete de knockout génico múltiple se construyó de forma sencilla y rápida mediante PCR de un solo paso sin necesidad de construir un plásmido, y el producto de la PCR puede utilizarse inmediatamente para la eliminación del gen diana. Como ejemplo de las aplicaciones de esta estrategia, hemos creado con éxito una cepa de S. acidocaldarius deficiente en ADN fotoliasa (phr-) y arginina descarboxilasa (argD-). Además, también se estableció un sistema de selección de agmatina consistente en una cepa agmatina-auxotrófica y un marcador argD. El MONSTER proporciona una estrategia alternativa que permite la construcción muy sencilla de casetes de eliminación de múltiples genes para estudios genéticos en S. acidocaldarius.

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