El sésamo es uno de los cultivos de semillas oleaginosas más importantes cultivados en todo el mundo. Proporciona diversos nutracéuticos, incluidos lignanos, ácidos grasos insaturados (UFA), fitoesteroles, etc., a los seres humanos. Entre los nutracéuticos del sésamo, los fitoesteroles han recibido menos atención de los mejoradores de sésamo, aunque se han registrado sus funciones biológicas y farmacológicas. Por lo tanto, en el presente estudio, evaluamos la variación de los contenidos de fitoesteroles en 402 accesiones de sésamo cultivadas en dos ambientes y revelamos sus loci asociados y genes candidatos. El análisis de cromatografía de gases (GC) reveló que el sésamo contiene principalmente cuatro fitoesteroles: campesterol, estigmasterol, beta-sitosterol y 5-avenasterol. El beta-sitosterol (1,6-4,656 mg/g) fue el fitoesteroles principal, seguido por el campesterol (0-2,847 mg/g), el estigmasterol (0,356-1,826 mg/g) y el 5-avenasterol (0-1,307 mg/g). El contenido total de fitoesteroles varió de 2,694 a 8,388 mg/g. El estudio de asociación de todo el genoma identificó 33 loci de polimorfismo de nucleótido único (SNP) significativamente asociados para los cuatro rasgos, de los cuales Ch6-39270 y Ch11-142842 fueron ambientalmente estables y simultáneamente vinculados con la variación del contenido de campesterol y estigmasterol. La selección de genes candidatos indicó que la codificación de una proteína que contiene un dominio NAC 43 es probablemente el gen de efecto candidato principal de la variación de fitoesteroles en el sésamo. Los resultados de este estudio amplían el conocimiento de la variación de fitoesteroles en el sésamo y proporcionan recursos importantes para la cría asistida por marcadores de variedades con alto contenido de fitoesteroles.