Se ha desarrollado un método cromatográfico de líquidos de alto rendimiento simple, sensible, económico y rápido que indica la estabilidad para la determinación de gemcitabina en formas farmacéuticas inyectables utilizando teofilina como estándar interno. La separación cromatográfica se logró en una columna Phenomenex Luna C-18 (250 mm × 4,6 mm; 5μ) con una fase móvil compuesta por 90% de agua y 10 cetonitrilo (pH 7,00±0,05). Las señales de gemcitabina y teofilina se registraron a 275 nm. Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de concentración de 0,5-50 μg/mL. El coeficiente de correlación fue de 0,999 o superior. El límite de detección y el límite de cuantificación fueron 0,1498 y 0,4541 μg/mL, respectivamente. La precisión inter e intradiaria fue inferior al 2%. La exactitud del método osciló entre el 100,2% y el 100,4%. Los estudios de estabilidad indican que el fármaco era estable a la luz solar y a la luz UV. El fármaco da 6 productos hidrolíticos diferentes bajo estrés alcalino y 3 en condición ácida. Las condiciones de estrés acuoso y oxidativo también degradan el fármaco. La degradación fue mayor en la condición alcalina en comparación con otras condiciones de estrés. La robustez de los métodos se evaluó mediante el diseño de experimentos. La validación revela que el método propuesto es específico, exacto, preciso, fiable, robusto, reproducible y adecuado para el análisis cuantitativo.