Demostramos previamente que la sustitución parcial de forraje con fuentes de fibra no forrajera (NFFS) en dietas de vacas lecheras podría disminuir la proporción ruminal de acetato a propionato, lo que lleva a cambios en la expresión de miARN de vesículas extracelulares (EV) circulatorias y lácteas. Este estudio exploró además los efectos de las dietas NFFS en las proteínas de EV de la leche, que se propusieron como ingredientes bioactivos en investigaciones recientes. Sustituimos 8.97% de heno de alfalfa y 2.51% de ensilaje de maíz con 5.72% de semilla entera de algodón y 4.73% de cáscara de soja en la dieta de las vacas, reduciendo la fibra detergente neutra del forraje de 20.92% a 15.67%. En total se identificaron 488 proteínas mediante el proteoma, y 65 proteínas se expresaron diferencialmente en respuesta a las dietas NFFS, cuyas funciones estaban principalmente enriquecidas en vías relacionadas con la inmunidad, incluyendo cascadas de complemento y coagulación, fagocitosis, infección y vías de señalización de quimiocinas. Además, 57 proteínas de EV de la leche, principalmente atribuidas a enzimas, proteínas del citoesqueleto y proteínas de transporte, estaban entre las 100 proteínas de EV más identificadas en diferentes especies y fluidos corporales, lo que podría estar relacionado con la biogénesis, estructura y tráfico de todas las vesículas. Los resultados mostraron que las dietas NFFS podrían influir en la composición de proteínas de EV de la leche de vaca, lo que implica que podríamos adoptar estrategias nutricionales efectivas para promover la síntesis de ingredientes funcionales de la leche. En conjunto con todos nuestros estudios, se recomendaron las dietas NFFS para mejorar el modelo de fermentación ruminal y enriquecer las proteínas de EV de la leche de vacas lecheras.