Pseudoplatystoma corruscans (Spix y Agassiz, 1829) y Pseudoplatystoma reticulatum (Eingenmann y Eigenmann, 1889) son grandes bagres migratorios de gran importancia biológica y gran valor comercial en Sudamérica. Dado que se pueden producir cruces fértiles artificialmente en criaderos, es concebible una alta proximidad genética entre estas dos especies de Pimelodidae. El posible escape de ejemplares cruzados de las estaciones piscícolas constituye una grave preocupación ambiental. A pesar de su importancia, el conocimiento sobre la biología, ecología, diversidad poblacional y genética de P. corruscans y P. reticulatum es limitado. En el presente trabajo, se analizó la divergencia genética entre las poblaciones de P. corruscans y P. reticulatum de la cuenca del río Paraná basándose en polimorfismos en fragmentos ISSR y en la secuencia hipervariable de la región de control del ADN mitocondrial (ADNmt). Las estimaciones del haplotipo intraespecífico (h > 0,5) y la diversidad de nucleótidos (π < 0,01) indican que P. corruscans y P. reticulatum han sobrevivido a un declive poblacional histórico, seguido de una expansión demográfica. Los polimorfismos interespecíficos en la región de control del ADNmt y los fragmentos ISSR resultaron adecuados como marcadores moleculares de diagnóstico y podrían utilizarse para discriminar entre ambas especies. Un ejemplar único de Pseudoplatystoma, capturado en la llanura aluvial del Alto Paraná, fue identificado mediante estos marcadores de diagnóstico de ADN como un híbrido P. reticulatum × P. corruscans, posiblemente procedente de la piscicultura. La integridad de la población natural de P. corruscans en el Alto Paraná corre el riesgo de introgresión u homogeneización genética debido a la presencia de híbridos y a la transposición de P. reticulatum aguas arriba a través del Canal da Piracema en la presa de Itaipú. Los datos presentados aquí mejoran la comprensión de la relación genética entre P. corruscans y P. reticulatum y representan herramientas potenciales para futuros programas de conservación y vigilancia de eventos de introgresión genética y la integridad genética de estas poblaciones.