La enfermedad del nudo del olivo, causada por pv., impacta severamente el rendimiento del olivo y la calidad del aceite. La detección temprana y precisa de la presencia de la bacteria, particularmente en plantas asintomáticas, es crucial para un manejo efectivo de la enfermedad. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo mejorado para el procesamiento de muestras de plantas y adaptar la PCR cuantitativa a la PCR digital en gota (ddPCR). Para este propósito, se probaron cuatro preparaciones de plantas: EW (lavado externo), PELLET (concentración bacteriana) y enriquecimiento en medios líquidos durante 24 o 48 h (24hE, 48hE) utilizando muestras espiked. La ddPCR se configuró y se comparó con la qPCR para evaluar la sensibilidad y especificidad analíticas. Además, se probaron muestras de campo de olivares sintomáticos y asintomáticos para evaluar el rendimiento de los métodos seleccionados en plantas infectadas de forma natural. La ddPCR mostró una mayor sensibilidad que la qPCR, particularmente con las preparaciones PELLET y 24hE. El PELLET de la preparación de muestra espiked logró un límite de detección de 10 CFU/mL para ambas pruebas moleculares. La ddPCR, combinada con la preparación PELLET, ofrece una herramienta altamente sensible y confiable para detectar pv. en material de olivo asintomático. Este protocolo muestra un gran potencial para mejorar la detección temprana de bacterias y la prevención de enfermedades, ayudando así a las estrategias de control en viveros y olivares, y apoyando la producción de material de propagación vegetal certificado.