Los entornos microbianos sub-sedimentarios exhiben grandes efectos de fraccionamiento de isótopos de carbono como resultado de reacciones enzimáticas microbianas. El carbono inorgánico disuelto (DIC) isotópicamente ligero, derivado del carbono orgánico, se libera comúnmente en el agua intersticial debido a los procesos disimilatorios microbianos que prevalecen en la biosfera subsuperficial. Sin embargo, ocurre un fraccionamiento de isótopos de carbono mucho más fuerte durante la metanogénesis, donde el metano se empobrece en C y, por balance de masas, el DIC se enriquece en C, de modo que las distribuciones isotópicas están predominantemente influenciadas por los metabolismos microbianos que involucran metano. Los metabolismos de metano son esencialmente mediados a través de una única vía enzimática tanto en como en , la vía Wood-Ljungdahl (WL), pero sigue sin estar claro dónde en la vía ocurre el fraccionamiento de isótopos de carbono. Si bien se asume generalmente que el fraccionamiento surge de efectos cinéticos de reacciones enzimáticas, se ha sugerido recientemente que ocurre una equilibración parcial de isótopos de carbono dentro de la vía de oxidación anaeróbica de metano. El fraccionamiento en equilibrio también podría ocurrir durante la metanogénesis, ya que la diferencia isotópica entre DIC y metano comúnmente está en el orden de 75, que está cerca del equilibrio termodinámico. La firma isotópica en DIC y metano varía mucho en aguas intersticiales marinas, reflejando la distribución de diferentes metabolismos microbianos que contribuyen al DIC. Si los isótopos de carbono se preservan en carbonatos diagenéticos, pueden proporcionar una poderosa biosignatura para las condiciones en la biosfera profunda, específicamente en proximidad a la zona de transición sulfato-metano. Se han encontrado grandes variaciones en las firmas isotópicas en archivos diagenéticos que documentan cambios dramáticos en la actividad de la biosfera sub-sedimentaria a lo largo de escalas de tiempo geológico. Presentamos una breve visión general sobre los isótopos de carbono, incluidos los mecanismos de fraccionamiento microbiano, efectos de transporte, preservación en archivos de carbonatos diagenéticos y sus implicaciones para la biosfera sub-sedimentaria pasada y su papel en el ciclo global del carbono. Discutimos preguntas abiertas y futuros potenciales de los isótopos de carbono como archivos para rastrear la biosfera profunda a través del tiempo.