La biomasa microalgal es una fuente sostenible de lípidos bioactivos con ácidos grasos omega-3. La extracción eficiente de lípidos neutros y polares de microalgas requiere métodos de extracción alternativos, frecuentemente combinados con un pretratamiento de la biomasa. En este trabajo, se optimizó un proceso combinado de ultrasonido y enzimático utilizando enzimas comerciales Viscozyme, Celluclast y Alcalase como método de pretratamiento, donde se utilizó el método de Folch para la extracción de lípidos. Se observaron diferencias significativas entre los pretratamientos enzimáticos utilizados, combinados con baño de ultrasonido o sonicación de tipo sonda. Para optimizar aún más este método, se probaron rangos de temperaturas (35, 45 y 55 grados Celsius) y pH (4, 5 y 8), y se combinaron enzimas en las mejores condiciones. Posteriormente, el uso simultáneo de tres enzimas hidrolíticas produjo rendimientos de aceite de casi el 29%, mostrando un efecto sinérgico. Para comparar los pretratamientos enzimáticos, la distribución de lípidos neutros y polares se determinó mediante HPLC-ELSD. El contenido más alto de lípidos polares se logró empleando el pretratamiento enzimático asistido por ultrasonido (55 grados Celsius y 6 h), mientras que los contenidos más altos de glicolípidos (44,54%) y PE (2,91%) se lograron utilizando Viscozyme en comparación con otras enzimas. El método se aplicó a otras microalgas mostrando el potencial del proceso optimizado como una alternativa práctica para producir lípidos valiosos para aplicaciones nutracéuticas.