Las nanoesferas de ADN autoensambladas, como vehículos versátiles e ideales, han ofrecido nuevas oportunidades para crear sistemas de entrega inteligentes para bioimágenes precisas y terapia del cáncer, debido a su buena biostabilidad y permeabilidad celular, gran capacidad de carga y comportamientos de autoensamblaje programables. Las nanoesferas de ADN se pueden sintetizar mediante el autoensamblaje de monómeros de ADN en forma de Y, ADN de cadena sencilla (ssDNA) ultra largo e incluso coordinación metal-ADN. Curiosamente, su tamaño se puede controlar variando algunos parámetros, incluyendo concentración, tiempo de reacción y relación de mezcla. Esta revisión resume el diseño de nanoesferas de ADN y sus amplias aplicaciones biomédicas. Primero, se introducen brevemente las características del ADN y se mencionan diferentes nanoestructuras de ADN. Luego, se enfatiza el diseño de las nanoesferas de ADN y se clasifica en tres categorías principales, incluyendo el autoensamblaje de unidades de ADN en forma de Y mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick, cristalización líquida y el empaquetamiento denso de hebras de ADN ultra largas generadas a través de la amplificación por círculo rodante (RCA), y híbridos impulsados por coordinación metal-ADN. Mientras tanto, se discuten las ventajas y desventajas de diferentes nanoesferas de ADN autoensambladas, respectivamente. A continuación, se centra principalmente en las aplicaciones biomédicas de las nanoesferas de ADN. Especialmente, las nanoesferas de ADN sirven como nanotransportadores prometedores para entregar ácidos nucleicos funcionales y medicamentos para biosensores, bioimágenes y terapias. Finalmente, se presentan los desafíos actuales y las perspectivas para las nanoesferas de ADN autoensambladas en el futuro.