La ionización por electrospray (ESI) es una técnica de ionización suave muy utilizada para la producción de iones en fase gaseosa (sin fragmentación) de grandes supramoléculas térmicamente lábiles. En la presente revisión hemos descrito el desarrollo de la espectrometría de masas por ionización por electrospray (ESI-MS) durante los últimos 25 años en el estudio de varias propiedades de diferentes tipos de moléculas biológicas. Se han realizado amplios estudios sobre el mecanismo de formación de especies gaseosas cargadas por la ESI. Varios grupos han investigado el origen y las implicaciones de los múltiples estados de carga de las proteínas observados en los espectros de masas ESI de las proteínas. Los analitos cargados producidos por la ESI pueden fragmentarse activándolos en la fase gaseosa, y así se ha desarrollado la espectrometría de masas en tándem, que proporciona conocimientos muy importantes sobre las propiedades estructurales de la molécula. La revisión destacará los desarrollos recientes y las direcciones emergentes en esta fascinante área de investigación.