La biogeografía microbiana en ecosistemas terrestres y de agua dulce está principalmente dominada por los estilos de vida de biofilm comunitario. Aquí, describimos aplicaciones de microscopía asistida por computadora utilizando el software de informática de bioimagen CMEIAS (Centro para el Análisis de Imágenes de Ecología Microbiana) para un análisis integral de las arquitecturas y ecología de biofilms en ríos. Se desarrollaron biofilms naturales durante cuatro días de verano en portaobjetos de vidrio borosilicato plano y poliestireno transparente sumergidos en el río Red Cedar que fluye a través del campus de la Universidad Estatal de Michigan. Se adquirieron imágenes de las comunidades de biofilm utilizando microscopía de campo claro y de contraste de fase a resoluciones espaciales que revelan detalles de microcolonias y células individuales, luego se segmentaron digitalmente los objetos de interés en primer plano. Se extrajeron y evaluaron digitalmente características fenotípicas de su tamaño, abundancia, textura de superficie, morfología de contorno, geometría fractal, ecofisiología y ecología del paisaje/espacial mediante muchas pruebas estadísticas discriminatorias. Los resultados indican que la arquitectura del biofilm en ríos exhibe una estructura geoespacial significativa in situ, proporcionando muchas ideas sobre la fuerte influencia que la hidrofobicidad-humedad del sustrato ejerce sobre el desarrollo y la ecología del biofilm, incluyendo su productividad e intensidad de colonización, diversidad morfológica/dominancia/rareza condicional, asignación de nutrientes/eficiencia de absorción/utilización, alometría/actividad metabólica, respuestas a la inanición y estrés por bacterivoría, patrones espaciales de distribución/dispersion/conectividad, y autocorrelaciones interpoladas de interacciones celulares cooperativas/conflictivas a escalas espaciales del mundo real directamente relevantes para sus nichos ecológicos. El impacto significativo de la fisicoquímica del sustrato se reveló para los biofilms durante su etapa temprana e inmadura de desarrollo en el ecosistema fluvial. La informática de bioimagen puede llenar importantes vacíos en la comprensión de la geomicrobiología y la ecología microbiana de los biofilms in situ cuando se examinan a escalas espaciales adecuadas para el análisis fenotípico a resoluciones de microcolonia y de célula única.