Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos del fumarato y la nitroglicerina en la fermentación del rumen, la producción de metano e hidrógeno, y la microbiota. Se utilizó fermentación in vitro del rumen en este estudio con cuatro grupos de tratamiento: control (CON), fumarato (FA), nitroglicerina (NG) y fumarato más nitroglicerina (FN). Se utilizaron PCR en tiempo real y secuenciación del gen 16S rRNA para analizar la microbiota. Los resultados mostraron que la nitroglicerina inhibió completamente la producción de metano y que esto resultó en acumulación de hidrógeno. El fumarato disminuyó la acumulación de hidrógeno y mejoró los parámetros de fermentación del rumen. El fumarato aumentó la concentración de propionato y proteína cruda microbiana, y disminuyó la relación de acetato a propionato en FN. El fumarato, la nitroglicerina y su combinación no afectaron la abundancia de bacterias, protozoos y hongos anaerobios, pero alteraron las arqueas. El PCoA mostró que las comunidades bacterianas (Anosim, R = 0.747, p = 0.001) y arqueales (Anosim, R = 0.410, p = 0.005) eran diferentes entre los cuatro tratamientos. En comparación con CON, el fumarato restauró Bacteroidetes, Firmicutes, Spirochaetae, Actinobacteria, No clasificados, y en abundancia relativa en FN, pero no afectó a, y a los taxones arqueales. Los resultados indicaron que el fumarato alivió la depresión de la fermentación del rumen causada por la inhibición de la metanogénesis por la nitroglicerina. Esto podría proporcionar potencialmente una forma alternativa de utilizar estos químicos para mitigar la emisión de metano en rumiantes.