El análisis lipídico basado en ácidos grasos se ha utilizado ampliamente para evaluar el estado de salud en la medicina humana, así como en el campo veterinario. En las especies equinas, ha surgido un interés creciente en la fertilidad y la calidad del esperma. Los ácidos grasos, siendo los componentes principales de las membranas, desempeñan un papel activo en la regulación de las actividades metabólicas, y su papel en la espermiogénesis parece ser de gran importancia para la calidad resultante del esperma y, por lo tanto, la fertilidad. Con la aplicación de técnicas lipídicas ampliamente utilizadas, el objetivo de este estudio fue evaluar: (a) el contenido de ácidos grasos de las membranas de los espermatozoides de 26 burros machos Martina Franca sanos y su posible correlación con los parámetros del esperma, y (b) la evaluación de la composición de la membrana de los glóbulos rojos. Los PUFA omega-6 son los componentes principales (40.38%) del contenido total de PUFA (47.79%) en ambos tipos de células; sin embargo, el DPA es el predominante en la membrana de los espermatozoides (27.57%) pero no está presente en la membrana de los eritrocitos. La motilidad de los espermatozoides (%) está correlacionada positivamente con el ácido esteárico y el EPA, y la motilidad progresiva (%), con el ácido oleico. Estos hallazgos ofrecen información sobre la composición de las membranas de ambos tipos de células en burros MF machos sanos y reflejan las transformaciones metabólicas de la membrana de los espermatozoides durante el período de maduración, proporcionando una mejor percepción del papel de los ácidos grasos en los parámetros del esperma y la fertilidad.