El estudio actual propone la evaluación anticancerígena in vitro e in silico del aceite esencial de clavo (L.). El método de hidrodistilación al vapor utilizado produjo un 10.7% (peso) de aceite esencial. El análisis de GC-MS reveló que el aceite obtenido es rico en eugenol (75%), beta-cariofileno (20%) y alfa-cariofileno (2.8%), y también contiene varios otros componentes menores que representan aproximadamente un 1.5%. La actividad antioxidante de captura basada en DPPH se evaluó para el aceite esencial obtenido, exhibiendo un valor de IC de 158 g/mL. Se probaron los efectos citotóxicos del aceite esencial, su componente principal eugenol, y el aceite esencial solubilizado con Tween-20 y PEG-400 contra células no cancerosas HaCaT y adenocarcinoma colorrectal humano HT-29, melanoma RPMI-7951, carcinoma de piel A431 y células de cáncer de pulmón no microcítico NCI-H460, utilizando el ensayo de Alamar Blue y LDH después de un tratamiento de 48 h. Las formulaciones de aceite esencial con Tween-20 y PEG-400, a 200 g/mL, registraron los efectos citotóxicos y selectivos más altos contra RPMI-7951 (72.75% y 71.56%), HT-29 (71.51% y 45.43%) y células A431 (61.62% y 59.65%). Además, el aceite esencial interrumpió la función mitocondrial y desacopló la fosforilación oxidativa. Este efecto fue más potente para el aceite esencial contra las células RPMI-7951 y HT-29, mientras que para las otras dos líneas celulares probadas, una inhibición más potente de la función mitocondrial se atribuyó al eugenol. El presente estudio es el primero en investigar específicamente los efectos del aceite esencial y las formulaciones de aceite esencial con Tween-20 y PEG-400 en la función mitocondrial de las líneas celulares cancerosas RPMI-7951, HT-29, A431 y NCI-H460 utilizando respirometría de alta resolución, proporcionando nuevas perspectivas sobre su impacto en la respiración mitocondrial y la bioenergética en células cancerosas. Los resultados obtenidos pueden explicar el aumento de la producción de ROS observado en líneas celulares cancerosas tratadas con eugenol y aceite esencial. El acoplamiento molecular identificó posibles objetivos proteicos, relacionados con la actividad anticancerígena del aceite esencial, en forma de PI3Kalpha, donde el inhibidor teórico activo más alto fue calameneno (-7.5 kcal/mol). Los resultados de acoplamiento también mostraron que el calameneno fue el inhibidor teórico más activo en general para todas las proteínas acopladas e indicaron una posible presencia de efectos sinérgicos entre todos los constituyentes del aceite esencial.