La rápida aparición de patógenos bacterianos multirresistentes (MDR) representa una amenaza crítica para la salud global, creando una necesidad urgente de nuevos agentes antimicrobianos. En este estudio, evaluamos una pequeña biblioteca de fitocannabinoides naturales y semisintéticos contra un amplio panel de cepas bacterianas Gram-positivas MDR, evidenciando una muy buena actividad en el rango de bajas concentraciones micromolares. Proporcionamos evidencia de la actividad antibacteriana de los dos enantiómeros separados del cannabidiol, ofreciendo nuevas perspectivas sobre los aspectos estereoquímicos de su bioactividad. Para investigar los posibles objetivos moleculares y aclarar el mecanismo de acción, empleamos el Tamizaje Virtual Inverso (IVS), un enfoque computacional optimizado para predecir interacciones potenciales entre proteínas y ligandos, en tres especies bacterianas MDR seleccionadas. Curiosamente, se recuperaron objetivos clave pertenecientes a importantes vías metabólicas bacterianas y mecanismos de defensa, y los resultados se utilizaron para racionalizar las actividades biológicas observadas. Hasta donde sabemos, este estudio marca la primera aplicación de IVS a microorganismos, ofreciendo una nueva estrategia para identificar objetivos proteicos bacterianos. Los resultados allanan el camino para futuras validaciones experimentales, diseño de fármacos basado en estructuras y el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos.