La vía de metilación de ADN dirigida por ARN (RdDM) es un mecanismo epigenético crucial que rige las respuestas de las plantas al estrés ambiental. Aunque la vía RdDM ha sido estudiada extensamente, la comprensión integral de sus componentes en el pepino (Cucumis sativus) sigue siendo insuficiente. En este estudio, realizamos una identificación y caracterización a nivel genómico de los genes de la vía RdDM en el pepino, seguida de un análisis de sus patrones de expresión en varios tejidos y bajo múltiples condiciones de estrés abiótico. Se identificaron un total de 67 genes putativos, que están distribuidos de manera desigual a lo largo de los cromosomas del pepino. Los análisis filogenéticos y de estructura génica revelaron una considerable divergencia evolutiva, particularmente dentro de la familia de genes Argonaute clave. Crucialmente, se encontró que las regiones promotoras de los genes contenían elementos cis-regulatorios asociados con el estrés abiótico, la señalización de luz y el desarrollo, lo que sugiere su posible participación en redes regulatorias complejas. Los ensayos de RT-qPCR confirmaron que los genes exhiben patrones de transcripción distintos y específicos del estrés. Notablemente, varios genes mostraron una expresión antagónica entre raíces y hojas bajo estrés por sequía (PEG-6000), lo que implica un sofisticado mecanismo de defensa específico del tejido. Entre ellos, emergió como un gen candidato sensible al estrés abiótico. Estos hallazgos proporcionan nuevas perspectivas sobre los roles regulatorios de los genes bajo estrés abiótico y destacan genes candidatos para la mejora genética de la tolerancia al estrés en el pepino.