La autenticación visual de trufas de alto valor es un desafío, ya que comparten características morfológicas similares con otras especies de trufas que tienen un menor valor económico. Esta similitud complica la identificación precisa y aumenta el riesgo de sustitución o etiquetado incorrecto, lo que puede afectar tanto los precios de mercado como la confianza del consumidor. Por esta razón, el objetivo de este estudio fue aplicar un enfoque lipidómico no dirigido utilizando espectrometría de movilidad iónica-espectrometría de masas para distinguir entre especies de trufas blancas y negras y determinar los diferentes orígenes geográficos de las dos especies de trufas más valiosas. Entre varios cientos de características, se identificaron 37 y 57 lípidos como compuestos marcadores para distinguir entre especies de trufas blancas y negras utilizando espectros de MS/MS y valores de sección transversal de colisión (CCS), respectivamente. Solo fueron necesarios unos pocos compuestos marcadores para reconocer las diferencias entre trufas blancas y negras. En particular, ceramidas, glicerolípidos y fosfolípidos resultaron ser especialmente adecuados para separar las especies. Además, se determinaron perfiles metabólicos diferentes para las trufas blancas y negras dependiendo de su origen geográfico. Estos hallazgos sientan las bases para un marco de control de calidad integral para las trufas frescas, asegurando la autenticidad, detectando la adulteración y preservando su estatus premium.