L. (alfalfa) es un cultivo forrajero importante debido a su alto rendimiento y resistencia al estrés. Sin embargo, su crecimiento y productividad a menudo se ven comprometidos por estrés abiótico, incluyendo frío, sequía y salinidad. La familia de genes defensina de planta (PDF) juega un papel crucial en la resistencia al estrés abiótico. En este estudio, se identificaron un total de 11 miembros de la familia de genes MsPDF en el genoma de la alfalfa y se clasificaron en tres grupos. Los análisis filogenéticos y de motivos conservados revelaron que los genes MsPDF son altamente conservados. Se utilizaron análisis de promotores, análisis de redes regulatorias de genes (GRN) y análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) para inferir las funciones potenciales de los genes. Los resultados mostraron que el gen responde activamente al estrés abiótico, participa en respuestas fitohormonales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas a través de interacciones genéticas. Los análisis de transcriptoma y qRT-PCR mostraron que la mayoría de los genes estaban significativamente regulados al alza bajo estrés por frío, sequía y salinidad. Entre ellos, mostraron un rendimiento superior bajo estrés por frío. Los genes , , y fueron capaces de responder positivamente a los estreses por sequía y sal. Finalmente, se predijeron las estructuras monoméricas, diméricas y tetraméricas de las proteínas codificadas por los genes utilizando el software AlphaFold 2. Este estudio sienta las bases para la identificación y análisis de la relación evolutiva de la familia de genes MsPDF, y proporciona una nueva referencia para investigaciones posteriores sobre la resistencia al estrés abiótico.