En el proceso de extracción del aceite de oliva virgen extra (AOVE), se demostró la presencia de levaduras que podrían afectar la calidad del aceite de oliva. Por lo tanto, en este trabajo, en primer lugar, se cuantificaron las levaduras presentes durante diferentes procesos extractivos realizados en un molino de aceite de Toscana, al principio, en el medio y al final de la cosecha en la misma temporada de cultivo. Luego, se evaluaron los posibles efectos en la calidad del AOVE causados por las especies de levaduras predominantes, que poseen actividades enzimáticas específicas. Las concentraciones de levaduras fueron más altas en los procesos de extracción al final de la cosecha. Doce especies de levaduras que mostraban diferentes frecuencias de aislamiento durante el proceso extractivo del aceite de oliva y de acuerdo con la fecha de cosecha fueron identificadas mediante métodos moleculares. Las especies de levaduras que dominaban las muestras de aceite de oliva del decantador presentaban actividades enzimáticas, que podrían afectar la calidad del AOVE según el análisis de zimograma. El análisis de HS-SPME-GC-MS de los compuestos volátiles en AOVE comercial, inoculado con tres especies de levaduras (, , ), señaló diferencias significativas dependiendo de la cepa inoculada. En conclusión, durante los procesos extractivos del aceite de oliva, algunas especies de levaduras colonizan la planta de extracción y pueden influir en las características químicas y sensoriales del AOVE según las concentraciones celulares y sus capacidades enzimáticas.