La regeneración de cofactores es indispensable para evitar la adición de grandes cantidades de cofactor NADH o NAD en reacciones de oxidación-reducción. La NADH oxidasa formadora de agua (Nox) ha atraído una atención sustancial ya que puede oxidar NADH citosólico a NAD sin acumulación concomitante de subproductos. Sin embargo, sus aplicaciones tienen algunas limitaciones en ciertos procesos de oxidación-reducción cuando su pH óptimo es diferente al de sus enzimas acopladas. En este estudio, para modificar el pH óptimo de BsNox, se seleccionaron quince candidatos relevantes de mutaciones dirigidas por sitio basadas en un diseño racional de carga superficial. Como se predijo, la sustitución de este residuo de asparagina por un residuo de ácido aspártico (N22D) o por un residuo de ácido glutámico (N116E) desplaza su pH óptimo de 9.0 a 7.0. Posteriormente, el mutante combinado N20D/N116E no solo pudo reducir el pH óptimo de BsNox, sino que también aumentó significativamente su actividad específica, que fue aproximadamente 2.9 veces mayor a pH 7.0, 2.2 veces a pH 8.0 y 1.2 veces a pH 9.0 que la del tipo salvaje. El doble mutante N20D/N116E muestra una mayor actividad en un amplio rango de pH de 6 a 9, que es más amplio que el tipo salvaje. La usabilidad de BsNox y sus variaciones para la regeneración de NAD en un ambiente neutro se demostró al acoplarse con una deshidrogenasa de glutamato para la producción de ácido alfa-cetoglutárico (alpha-KG) a partir de ácido L-glutámico (L-Glu) a pH 7.0. Emplear la variación N20D/N116E como coenzima de regeneración de NAD+ podría acortar la duración del proceso; el 90% de L-Glu se transformó en alpha-KG en 40 minutos frente a 70 minutos con el BsNox tipo salvaje para la regeneración de NAD. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que las propiedades prometedoras de la variación N20D/N116E de BsNox son competentes en aplicaciones de regeneración de NAD en un ambiente neutro.