La enfermedad de la hoja amarilla (YLD), causada por el fitoplasma de la hoja amarilla de la palma de areca (APYL), representa una amenaza significativa para la sostenibilidad de la industria de la palma de areca. La detección oportuna y precisa es esencial para diagnosticar y gestionar eficazmente esta enfermedad. Este estudio desarrolló un nuevo sistema de PCR anidada utilizando cebadores diseñados específicamente a partir de regiones conservadas de la secuencia 16S rDNA del fitoplasma para superar limitaciones como los falsos positivos a menudo asociados con cebadores universales de PCR anidada. Los pares de cebadores resultantes HNP-1F/HNP-1R (externo) y HNP-2F/HNP-2R (interno) amplificaron consistentemente un fragmento distinto de 429 pb de cepas de APYL pertenecientes a los grupos 16SrI y 16SrII. La sensibilidad de detección alcanzó 7.5 x 10 ng/L para 16SrI y 4 x 10 ng/L para 16SrII. La validación en campo utilizando muestras de hojas de palmas de areca sintomáticas confirmó la alta especificidad y fiabilidad de los nuevos cebadores en la detección de APYL. En comparación con los cebadores universales convencionales (P1/P7 y R16mF2/R16mR1), este sistema de PCR anidada recién desarrollado demostró una mayor especificidad, sensibilidad y rapidez, convirtiéndolo en una herramienta valiosa para el diagnóstico temprano y la gestión de YLD en palmas de areca.