El biomaterial polihidroxibutirato (PHB) es un polímero prometedor, renovable y ecológico. En este estudio se propuso un método para incorporar la deleción de gluconato 6-fosfato deshidratasa (edd) en Escherichia coli que expresa genes de biosíntesis de PHB provenientes de la cepa Cupriavidus necator A-04. El crecimiento de la cepa deficiente en edd, que presenta un defecto en la vía glicolítica Entner–Doudoroff, disminuyó significativamente en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con glucosa. Sorprendentemente, en comparación con la cepa silvestre, la cepa recombinante deficiente en edd que expresaba los genes de biosíntesis de PHB mostró una acumulación rápida de PHB con un alto contenido del mismo. La cepa deficiente en edd alcanzó la mayor concentración de PHB de 7.6 g/L y un contenido del 93% en peso en 30 h de cultivo a escala de matraz cuando se utilizó glucosa comercial como única fuente de carbono. Además, la cepa resultante fue capaz de utilizar glicerol crudo residual de la industria de biodiésel para la acumulación de PHB, alcanzando un 74.8% en peso en 24 h. Los rendimientos de PHB obtenidos a partir de glucosa y glicerol crudo fueron de 0.37 y 0.20 g PHB/g de sustrato, respectivamente. Estos hallazgos no solo amplían la comprensión del efecto del metabolismo de la glucosa sobre la producción de PHB, sino que también proporcionan candidatos prometedores para la producción futura de polihidroxialcanoatos.