Las semillas de cáñamo se consideran un alimento funcional por su contenido favorable de ácidos grasos esenciales, proteínas y antioxidantes. Más allá de los fenoles y carotenoides, la bioactividad de las proteínas ha sido investigada recientemente. Sin embargo, el genotipo de la planta y las condiciones ambientales pueden afectar la cantidad y calidad de macronutrientes y fitoquímicos en las semillas, influyendo en sus propiedades nutracéuticas. En este estudio, se evaluaron los efectos de la variedad de planta y el origen de las semillas en el perfil de proteínas y la actividad antioxidante de las semillas de cáñamo. Se cosecharon semillas de dos cultivares, Secuieni Jubileu y Finola, de un campo montañoso ubicado en Italia y se compararon con semillas de referencia utilizadas para la siembra. Se obtuvieron extractos de albúmina y globulina utilizando el método de Osborne y se evaluó su poder antioxidante (métodos DPPH y ABTS). Se desarrolló un método de espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) para el análisis de huellas proteicas. Las albúminas de las semillas del sitio montañoso mostraron una mayor actividad de captura de radicales y compuestos de menor peso molecular que las semillas de referencia, lo que sugiere un papel de las proteínas en la bioactividad observada. El método MALDI-TOF discriminó las muestras según su origen y variedad, destacando cambios en el perfil de proteínas e identificando señales que podrían usarse como marcadores de cultivares de cáñamo.