Este documento describe un inmunoensayo combinado de antígeno/anticuerpo implementado en una placa de 96 pocillos utilizando el método espectroscópico fluorescente. En primer lugar, se utilizó IgG anti-humana de cabra para capturar IgG humana (antígeno modelo); se utilizó IgG anti-humana de cabra (Cy3 o FITC) para detectar el antígeno modelo; luego se añadió un nivel saturante de antígeno modelo seguido de IgG anti-humana de cabra sin etiquetar (anticuerpo modelo); finalmente, se utilizó IgG anti-cabra de conejo etiquetada con Cy3 para detectar el anticuerpo modelo. Se aplicaron dos enfoques al ensayo concomitante para analizar la viabilidad. El primer enfoque aplicó FITC y Cy3 cuando ambos objetivos estaban presentes al mismo tiempo, lo que resultó en un límite de detección de anticuerpos de 50 ng/mL y un límite de detección de antígeno de 10 ng/mL en las mediciones cuantitativas de la concentración del objetivo, teniendo en cuenta la eficiencia de FRET del 68% entre donante y aceptor. El enfoque secuencial tendió a disminuir la relación señal/ruido (S/N) y la detección del antígeno modelo (inferior a 1 ng/mL) tuvo una sensibilidad mejor que el anticuerpo modelo (inferior a 50 ng/mL). Este método combinado de antígeno/anticuerpo podría ser útil para la detección combinada de antígenos y anticuerpos. Será útil para cribar tanto antígenos como anticuerpos, especialmente en situaciones de infecciones virales multiserotipo y mutantes de alta frecuencia.