La toxicidad del aluminio (Al) es una de las principales limitaciones para la producción de cultivos en suelos ácidos. Los microARNs (miARNs) han surgido como moléculas reguladoras clave a niveles post-transcripcionales, desempeñando roles cruciales en la modulación de diversas respuestas al estrés en las plantas. Sin embargo, los miARNs y sus genes objetivo que confieren tolerancia al Al han sido poco estudiados en el olivo (L.). Aquí, se investigaron los cambios de expresión a nivel genómico en los miARNs de las raíces de dos genotipos de olivo contrastantes, Zhonglan (ZL, tolerante al Al) y Frantoio selezione (FS, sensible al Al), mediante enfoques de secuenciación de alto rendimiento. Se descubrieron un total de 352 miARNs en nuestro conjunto de datos, que consisten en 196 miARNs conservados y 156 miARNs nuevos. Los análisis comparativos mostraron que 11 miARNs tienen patrones de expresión significativamente diferentes en respuesta al estrés por Al entre ZL y FS. La predicción in silico identificó 10 genes objetivo putativos de estos miARNs, incluidos factores de transcripción MYB, proteínas homeobox-leucina zipper (HD-Zip), factores de respuesta a auxinas (ARF), transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y antiportadores de eflujo de potasio. Un análisis funcional adicional de clasificación y enriquecimiento reveló que estos pares de miARN-mRNA asociados a la tolerancia al Al están principalmente involucrados en la regulación transcripcional, señalización hormonal, transporte y metabolismo. Estos hallazgos proporcionan nueva información y perspectivas sobre los roles regulatorios de los miARNs y sus objetivos para mejorar la tolerancia al Al en los olivos.