El uso tradicional de plantas medicinales en todo el mundo tiene una larga historia, predominantemente en países de ingresos bajos y medianos. Investigaciones etnobotánicas previas relacionadas con entornos urbanos demostraron que el legado del uso de especies de plantas medicinales persiste en todo el mundo; sin embargo, la información sobre la principal ciudad en la parte occidental de México es escasa respecto a este conocimiento tradicional y su variación durante las últimas décadas. Se creó una base de datos a partir de entrevistas con personas locales que habían habitado los barrios más antiguos de Guadalajara durante al menos 30 años y utilizando diferentes bases de datos electrónicas. Además, la correcta identificación taxonómica de las especies fue respaldada mediante corroboración a través de herbarios locales y otros digitales. Además, se realizó un Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) sobre la información de la base de datos para buscar relaciones entre las especies de plantas medicinales utilizadas. Se creó un inventario de 137 plantas medicinales, donde las especies de plantas más comúnmente utilizadas en los cinco antiguos barrios de la ciudad de Guadalajara fueron muicle, pirul, manzanilla, valeriana, calabaza, cola de caballo, tepezcohuite, salvia, canela, tila estrella, cedrón, uva, jengibre y gobernadora. Las enfermedades de los sistemas cardiovascular, digestivo, urinario, respiratorio, nervioso, muscular y reproductivo, así como los síndromes culturales, fueron tratados principalmente con estas especies de plantas. Además, se utilizaron para ocho propósitos médicos, seguidos de cinco prácticas medicinales. En contraste, solo se registraron dos usos medicinales para algunas especies. El PCoA explicó el 65.88% de la variación acumulada en los primeros tres ejes de ordenación y formó cuatro grupos de especies, que estaban relacionadas con su origen geográfico. Ocho de las catorce especies que se utilizan comúnmente como plantas medicinales son de América, y el resto proviene de Europa y Asia. Este estudio confirma la persistencia del conocimiento tradicional relacionado con las plantas medicinales, y las enfermedades abordadas empíricamente entre los habitantes de la ciudad de Guadalajara son comunes en otras partes del mundo y en diferentes regiones de México. Estos hallazgos están respaldados por bases de datos electrónicas que comprenden múltiples estudios relacionados con los compuestos fitoquímicos y la validación médica respecto a su actividad biológica, apoyando el uso empírico y la eficacia de estas plantas medicinales.